nature communications丨中国科学技术大学俞汉青、刘东风、程洲华共同设计crRNA编辑工具，实现灵活调节Cas12a活性！

2025年10月8日，中国科学技术大学俞汉青、刘东风、程洲华在Nature Communications 发表题为“Tailoring Cas12a functionality with a user-friendly and versatile crRNA variant toolbox”的研究论文,提出一种简洁高效的策略：通过系统性突变crRNA直接重复序列（DR），筛选出系列功能各异的crRNA突变体，并将其整合为crRNA工具箱以实现Cas12a活性的灵活调控。

利用这些突变体间的互补协同效应，作者成功提升了Cas12a在多种应用场景中的性能表现。该crRNA工具箱可实现表达水平的精细调控，提升碱基编辑精度，增强原核生物同源重组介导基因编辑中的转化与编辑效率，并促进快速、精准、一锅法、半定量核酸检测。综上，DR序列突变策略为Cas12a活性调控与功能优化提供了简单、灵活且多样化的选择方案。

为实现有效的活性调控，现有策略主要涉及对CRISPR组分的改造。部分研究者专注于蛋白质工程开发增强型突变体。另一些研究则集中于crRNA修饰，采用添加7核苷酸DNA延伸序列、引入2-氨基腺嘌呤（Z碱基）或截短/分割crRNA等策略。这些方法成功调控了Cas12a的核酸酶活性或提升了特异性，主要应用于体外核酸检测。尽管Cas12a工程化与crRNA修饰已取得重大进展，但提升现有系统的灵活性与简易性仍面临挑战。从灵活性角度看，针对Cas12a或crRNA的定向改造虽能产生功能强大的突变体，却限制了其在特定场景中的应用（表1）。

例如，分裂 crRNA 策略在体内实施具有挑战性，而环状 crRNA 在细胞环境中提供了增强的稳定性，但在体外诊断应用中的实用性可能有限。就简单性而言，Cas12a突变体的体内构建和体外纯化都带来了相当大的工作量和成本。同样，人工修饰的 crRNA（例如掺入 2-氨基腺嘌呤或用 DNA 片段延伸的 crRNA）的合成仍然受到当前寡核苷酸合成技术的限制，使该过程既昂贵又耗时。因此，仍然需要一种灵活、简单的策略来高效、稳定地调控Cas12a活性，以促进其应用。

Cas12a crRNA的DR具有短茎环状结构，这对其稳定性和Cas12a识别至关重要（图1a)。同时利用crRNA引导DNase-dead Cas12a（dCas12a，D832A）23为了抑制绿色荧光蛋白（GFP）的表达，我们意外地观察到crRNA侧翼序列的突变导致荧光表达水平的变化（图1b 和补充图）。这一观察结果表明，Cas12a 活性可以通过 DR 序列的靶向改变来有效调节。此类突变可能会影响 RNA 构象，扰乱 Cas12a-crRNA 相互作用，从而影响 Cas12a-crRNA 核糖核蛋白 （RNP） 的整体功能。为了探索这种可能性，我们将DR序列分为三个部分——茎序列、环序列和侧翼序列——并在每个部分分别构建饱和突变体文库。

本文以来源于Lachnospiraceae细菌ND2006的LbCas12a为例，系统地探讨了crRNA直接重复（DR）序列突变对Cas12a活性的影响。利用DR序列突变体的易构建性和固有多样性，作者实现了Cas12a活性的灵活调控。作者通过高通量筛选构建了一个突变体工具箱，并通过体外表征验证了这些突变体赋予 Cas12a 独特的特性。利用crRNA突变体之间的互补性和协同作用，作者展示了该工具箱在不同应用场景中的实际适用性。具体来说，作者通过提供精细可调的表达抑制策略，实现更高的碱基编辑精度，提高原核生物中 LbCas12a 的同源重组介导的基因编辑效率，并解决 CRISPR-Dx 在快速、简单和准确的一锅和定量分析方面的固有局限性，解决了 CRISPR 干扰中的泄漏抑制问题。

文章来源：https://www.nature.com/articles/s41467-025-64010-z

图片来源网络如有侵权请及时联系删除！